Arg9/人抗HBsAg单链抗体/ EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活*分

作者：薛茜，温伟红，孟艳玲，张勇，张巍，王涛，张瑞，杨安钢

【关键词】肝炎,乙型；肝炎表面抗原,乙型；ScFv；Arg9

【Abstract】AIM:ToconstructR9/ScFv14/EGFPfusiongenesandtoanalyzethebindingactivityofthefusionproteinsaftertheywereexpressedinE.coliBL21.METHODS:AseriesofoligonucleotideprimersweredesignedandusedtoamplifythegenesofScFv14andR9/ScFv14.ThePCRproductswereclonedintopMD18Tvector,followedbyDNAsequencing.R9/ScFv14geneandScFv14genewereligatedwithEGFPgenerespectivelybeforetheywererebinedintotheexpressionvectorpET32a.AfterinducedinE.coliBL21byIPTG,theexpressedfusionproteinsnamedR9/ScFv14/EGFPandScFv14/EGFPweredetectedbySDSPAGEandthebindingactivityofthemwereanalyzedbyindirectELISA.RESULTS:RestrictionendonucleasedigestionandDNAsequencingprovedthatthetwofusiongeneswerecorrectlyconstructed.SDSPAGEanalysisshowedthattheyweresuccessfullyexpressedinE.coliBL21andthepercentagesofthemwere20%and25%oftotalbacteriaproteinsrespectively.IndirectELISAconfirmedthattheexpressedproductshadantigenspecificbindingactivity.CONCLUSION:Thetwofusiongeneswereconstructedsuccessfully.AndtheproductsofthemexpressedinE.coliBL21maintainedthebindingactivitytoHBsAg.

【Keywords】hepatitisB;hepatitisBsurfaceantigens;ScFv;Arg9

【摘要】目的：构建带有转膜结构域Arg9编码序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因，将其转化入大肠杆菌中进行表达，并分析表达产物与HBsAg的结合活*.方法：设计引物，将Arg9的编码序列引入单链抗体基因的5′端，PCR扩增后获得带有Arg9编码序列的ScFv14基因，将PCR产物连入pMD18T载体，进行序列测定.将测序正确的ScFv14基因和R9/ScFv14基因分别与EGFP基因连接后转化入原核表达载体pET32a，获得ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP两种融合基因的表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS，以IPTG诱导表达，对表达产物进行SDSPAGE分析，并用间接ELISA方法检测其与HBsAg的亲和活*.结果：经酶切鉴定及测序证实ScFv14/EGFP融合基因和R9/ScFv14/EGFP融合基因序列完全正确.SDSPAGE分析表明两种融合基因在大肠杆菌BL21中成功获得表达，表达量分别占菌体总蛋白的20%和25%.间接ELISA检测证实所表达的ScFv14/EGFP融合蛋白和R9/ScFv14/EGFP融合蛋白均具有HBsAg结合活*.结论：成功构建了带有转膜结构域Arg9编码序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因，并在大肠杆菌BL21中成功表达，表达产物ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP均具有与抗原HBsAg特异*结合的活*.

【关键词】肝炎，乙型；肝炎表面抗原，乙型；ScFv；Arg9

0引言

单链抗体（ScFv）是抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)通过一段连接肽(linker)连接而成的一种小分子抗体.其分子质量仅为完整抗体的1/6，不仅能较好地保持抗原结合能力，并且具有分子质量小、穿透力强、半衰期短、免疫原*低、制备流程简单等特点，更有利于体内应用［1-3］.绿*荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是从水母中分离出来的一种发光蛋白,可在A450nm～490nm的蓝光激发下发出绿*荧光，使用普通荧光显微镜即可进行观察.是近年来细胞生物领域中应用最为广泛的标记*蛋白质之一.EGFP为一种突变型GFP，所产生的荧光比野生型GFP增强，可作为

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